Erytrocyty przebudowują sieć białek w odpowiedzi na niedotlenienie. Kluczowa może być oś Band 3–BLVRB

Dojrzałe erytrocyty nie mają jądra komórkowego i nie mogą odpowiadać na zmiany środowiska poprzez uruchamianie ekspresji nowych genów. Nie oznacza to jednak, że są biernymi transporterami tlenu. Badanie opublikowane w czasopiśmie Blood pokazuje, że ich odpowiedź na hipoksję może opierać się na bardzo szybkiej przebudowie istniejącej sieci oddziaływań białkowych. Naukowcy zidentyfikowali 3775 białek w wysoko oczyszczonych ludzkich erytrocytach i opisali zależny od tlenu układ skupiony wokół białka Band 3 (SLC4A1) oraz reduktazy biliwerdynowej B (BLVRB).

Erytrocyt jest znacznie bardziej złożony, niż sugeruje jego uproszczony obraz

Dojrzały erytrocyt jest komórką wyjątkową. Podczas dojrzewania traci jądro komórkowe i większość organelli, w tym mitochondria. Nie prowadzi więc klasycznej odpowiedzi transkrypcyjnej i nie może w krótkim czasie wytworzyć nowych białek w odpowiedzi na niedotlenienie, stres oksydacyjny czy zmiany metaboliczne.

Mimo tego przez około 120 dni musi zachowywać integralność błony, gospodarkę energetyczną, zdolność do ochrony przed stresem oksydacyjnym oraz sprawnie reagować na gwałtowne zmiany prężności tlenu zachodzące podczas kolejnych przejść przez płuca i tkanki obwodowe.

Autorzy pracy opublikowanej w Blood postanowili dokładniej określić zarówno skład proteomu dojrzałych erytrocytów, jak i sposób, w jaki oddziaływania między tymi białkami zmieniają się zależnie od dostępności tlenu.

Do przygotowania podstawowego profilu proteomicznego wykorzystano erytrocyty od sześciu dawców – trzech kobiet i trzech mężczyzn. Materiał poddano leukoredukcji, a następnie sortowaniu FACS w celu maksymalnego ograniczenia obecności leukocytów, płytek krwi i retikulocytów. Było to istotne, ponieważ zanieczyszczenie preparatu innymi komórkami może sztucznie zawyżać liczbę białek przypisywanych dojrzałym erytrocytom.

Autorzy połączyli kilka metod proteomicznych i spektrometrii mas, a oddziaływania pomiędzy białkami badali przy użyciu chemicznego sieciowania białek w warunkach normoksji i hipoksji. Metabolizm oceniano również za pomocą znakowanej izotopowo glukozy. Wyniki mechanistyczne weryfikowano następnie m.in. w modelach mysich z modyfikacjami białka Band 3 oraz z brakiem BLVRB.

Dodatkową warstwę stanowiła analiza danych genetycznych i proteomicznych pochodzących od 13 091 dawców krwi.

W erytrocytach wykryto 3775 białek

W wysoko oczyszczonych dojrzałych ludzkich erytrocytach zidentyfikowano 3775 białek. Autorzy określają uzyskany zbiór jako najgłębszy jak dotąd profil proteomiczny dojrzałych erytrocytów uzyskany przy rygorystycznej kontroli zanieczyszczenia innymi typami komórek krwi.

Analiza wykazała także obecność licznych modyfikacji potranslacyjnych oraz rozbudowanej sieci fizycznych interakcji między białkami. To szczególnie istotne w komórkach pozbawionych możliwości syntezy nowych białek: ich krótkoterminowa adaptacja musi opierać się przede wszystkim na zmianach aktywności, lokalizacji, modyfikacji i wzajemnych oddziaływań już istniejących cząsteczek.

Jednym z głównych węzłów tej sieci okazało się białko Band 3, kodowane przez gen SLC4A1. Jest ono najlepiej znane jako bardzo obfite białko błonowe erytrocytów uczestniczące m.in. w wymianie anionów i organizacji cytoszkieletu, ale jego cytoplazmatyczny koniec N pełni również funkcję rusztowania dla białek metabolicznych.

Hipoksja przebudowuje interaktom erytrocytu

Kluczowym doświadczeniem było porównanie erytrocytów utrzymywanych w warunkach normoksji – 21% tlenu – oraz hipoksji – 1% tlenu. Zmiana dostępności tlenu spowodowała szeroką reorganizację sieci oddziaływań białkowych.

Zmiany dotyczyły niemal jednej trzeciej wykrywanych przez badaczy wiązań krzyżowych pomiędzy białkami. Nie oznacza to, że jedna trzecia wszystkich białek erytrocytu została wymieniona lub zmieniła swoją ilość. Przebudowie ulegał przede wszystkim sposób, w jaki już istniejące białka kontaktowały się ze sobą.

Szczególnie wyraźne zmiany dotyczyły kompleksu Band 3–hemoglobina. W hipoksji liczba wykrywanych kontaktów pomiędzy określonymi fragmentami N-końca Band 3 a podjednostkami odtlenowanej hemoglobiny wzrastała około trzykrotnie.

Jest to zgodne z wcześniej znanym modelem regulacji metabolizmu erytrocytu. W warunkach dobrego utlenowania część enzymów glikolitycznych może pozostawać związana z cytoplazmatycznym fragmentem Band 3. Gdy hemoglobina oddaje tlen, deoksyhemoglobina konkuruje o ten obszar, prowadząc do uwolnienia części enzymów metabolicznych i przesunięcia metabolizmu w stronę glikolizy.

Nowa interakcja Band 3–BLVRB

Jednym z najważniejszych nowych ustaleń pracy było wykrycie bezpośredniej interakcji pomiędzy Band 3 a reduktazą biliwerdynową B – BLVRB. Białko to występuje w dojrzałych erytrocytach w bardzo dużych ilościach, choć jego pełna rola w tych komórkach nie była dotąd jasna.

W normoksji BLVRB lokalizowała się częściowo przy błonie erytrocytu i współwystępowała przestrzennie z Band 3. Po obniżeniu dostępności tlenu BLVRB przemieszczała się w większym stopniu do cytozolu.

W badaniu proximity ligation assay sygnał wskazujący na bliskość Band 3 i BLVRB zmniejszał się podczas hipoksji o ponad 70%. Mikroskopia superrozdzielcza również pokazała zmniejszenie frakcji BLVRB związanej przestrzennie z Band 3 – z około 55% do około 30%.

Autorzy proponują więc model, w którym kompleks związany z Band 3 działa jak zależny od tlenu układ regulacyjny. Przy spadku utlenowania rośnie udział deoksyhemoglobiny związanej z N-końcem Band 3, natomiast BLVRB i część enzymów metabolicznych odłącza się od tego obszaru.

Możliwy udział sygnalizacji zależnej od tlenku azotu

Badanie dostarczyło również danych sugerujących, że Band 3, BLVRB, hemoglobina i dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego – GAPDH – mogą uczestniczyć w reakcjach związanych z przenoszeniem grup nitrozowych pomiędzy resztami cysteinowymi białek.

W doświadczeniach biochemicznych S-nitrozylacja katalitycznej cysteiny C152 GAPDH silnie hamowała aktywność tego enzymu. Taki mechanizm teoretycznie pozwalałby połączyć sygnały zależne od tlenu i tlenku azotu ze zmianą przepływu glukozy przez szlaki metaboliczne erytrocytu.

Należy jednak zachować ostrożność w interpretacji tego elementu pracy. Autorzy podkreślają, że kierunek, kinetyka i ewentualny enzymatyczny charakter obserwowanych reakcji przenoszenia sygnału NO nie zostały jeszcze w pełni ustalone. Część tych eksperymentów przeprowadzono w kontrolowanych warunkach in vitro.

Zmiana metabolizmu glukozy i produkcji 2,3-BPG

Przebudowie interaktomu towarzyszyły wyraźne zmiany metaboliczne. W hipoksji zwiększało się zużycie znakowanej glukozy oraz przepływ przez glikolizę, a jednocześnie nasilała się synteza 2,3-bisfosfoglicerynianu – 2,3-BPG.

2,3-BPG jest jednym z najważniejszych regulatorów powinowactwa hemoglobiny do tlenu. Wiążąc się z deoksyhemoglobiną, stabilizuje jej stan o niższym powinowactwie do tlenu i ułatwia oddawanie tlenu w tkankach.

W badaniu hipoksja powodowała około dwukrotny wzrost wykorzystania znakowanej glukozy i syntezy 2,3-BPG. Wyniki wspierają model, zgodnie z którym zmiana interakcji przy N-końcu Band 3 umożliwia szybkie przełączenie metabolizmu erytrocytu bez konieczności produkowania nowych białek.

Uszkodzenie układu Band 3–BLVRB zaburzało odpowiedź na hipoksję u myszy

Aby sprawdzić, czy obserwowane mechanizmy mają znaczenie na poziomie całego organizmu, badacze wykorzystali humanizowane modele mysie z modyfikacjami N-końca Band 3.

Analizowano między innymi wariant pozbawiony aminokwasów 1–11, odpowiadający obszarowi wiążącemu enzymy glikolityczne, oraz model bez aminokwasów 12–23, obejmujących obszar istotny dla wiązania deoksyhemoglobiny.

W prawidłowych erytrocytach hipoksja zwiększała produkcję mleczanu i uruchamiała szlak Rapoporta–Lueberinga prowadzący do syntezy 2,3-BPG. W erytrocytach z uszkodzonym N-końcem Band 3 odpowiedź ta była wyraźnie osłabiona.

Różnice pojawiły się również podczas testów wysiłkowych na bieżni. W modelu z delecją obszaru odpowiedzialnego za wiązanie deoksyhemoglobiny zdolność wysiłkowa oceniana poprzez parametr critical speed była obniżona o około 15% w porównaniu z kontrolą. W wariancie obejmującym pierwszy region N-końca różnica wynosiła około 5% i nie osiągnęła istotności statystycznej.

Autorzy nie wykryli przy tym oczywistego pierwotnego zaburzenia funkcji serca lub płuc, które tłumaczyłoby obserwowaną różnicę. Analizy tkanki mięśniowej również nie wskazywały na dominującą pierwotną przyczynę mięśniową.

Osobne doświadczenia z myszami pozbawionymi BLVRB dostarczyły dalszych argumentów za znaczeniem tego białka. Erytrocyty bez BLVRB nie potrafiły prawidłowo zwiększyć glikolizy w odpowiedzi na hipoksję, a zaburzenia były jeszcze bardziej widoczne w modelach łączących brak BLVRB z modyfikacją N-końca Band 3.

Co wyniki oznaczają dla hipoksji, wysiłku i chorób układu oddechowego?

Praca znacząco rozszerza obraz biologii erytrocytu. Dojrzała czerwona krwinka nie może w odpowiedzi na spadek stężenia tlenu rozpocząć ekspresji nowego zestawu genów, ale może bardzo szybko przeorganizować istniejące kompleksy białkowe i zmienić aktywność szlaków metabolicznych.

Oś Band 3–BLVRB może być jednym z mechanizmów integrujących dostępność tlenu, metabolizm glukozy, równowagę oksydacyjno-redukcyjną i gospodarkę 2,3-BPG.

Może to mieć znaczenie dla fizjologicznej odpowiedzi na niedotlenienie, ale również dla stanów, w których dostarczanie tlenu do tkanek jest zaburzone. Autorzy wskazują potencjalną przydatność swoich wyników m.in. w badaniach nad adaptacją wysokościową, fizjologią wysiłku, chorobami sercowo-płucnymi, podatnością erytrocytów na hemolizę oraz przechowywaniem i przetaczaniem krwi.

Są to jednak przede wszystkim potencjalne kierunki dalszych badań. W omawianej pracy nie badano bezpośrednio pacjentów z przewlekłą niewydolnością oddechową, osób z hipoksemią, sportowców ani ludzi przechodzących aklimatyzację wysokościową. Nie można więc na podstawie tych wyników określić, czy różnice w aktywności osi Band 3–BLVRB wpływają na wydolność wysiłkową człowieka albo przebieg konkretnej choroby płuc.

Nowy poziom regulacji w komórce pozbawionej jądra

Najważniejszym wnioskiem z pracy nie jest więc odkrycie pojedynczego „białka odpowiedzialnego za niedotlenienie”, ale pokazanie, że dojrzały erytrocyt dysponuje rozbudowanym systemem regulacji opartym na dynamicznym interaktomie.

Zmiana stopnia utlenowania hemoglobiny może wpływać na to, jakie białka zajmują określone miejsca przy Band 3, a w konsekwencji zmieniać aktywność glikolizy, szlaku Rapoporta–Lueberinga i mechanizmów redoks. Pozwala to erytrocytowi dostosowywać metabolizm w czasie znacznie krótszym niż byłoby to możliwe poprzez klasyczną zmianę ekspresji genów.

Badanie dostarcza szczegółowej mapy tego systemu i wskazuje BLVRB jako nowy element kompleksu zależnego od tlenu. Dopiero kolejne prace pokażą, w jakim stopniu mechanizm ten wpływa na różnice pomiędzy ludźmi oraz czy może mieć znaczenie diagnostyczne lub terapeutyczne w chorobach związanych z hipoksją.

Źródła