Nowe zastosowanie CRISPR w badaniach nad wariantami genetycznymi nowotworów
W ostatnich latach naukowcy opracowali szereg nowych metod opartych na technologii CRISPR-Cas, umożliwiających precyzyjną edycję materiału genetycznego żywych organizmów. Jednym z zastosowań tej technologii jest terapia komórkowa, gdzie komórki odpornościowe pacjenta są specyficznie przeprogramowane, aby skuteczniej walczyć z nowotworami.
Naukowcy z Katedry Systemów Biosystemów i Inżynierii na ETH Zurich w Bazylei, kierowani przez profesora Randalla Platta, znaleźli kolejne zastosowanie dla tych nowoczesnych metod CRISPR-Cas. Badacze wykorzystują je do dekodowania, w jaki sposób mutacje w genomie komórki wpływają na jej funkcjonowanie. Przykładowo, sekwencja DNA w komórkach nowotworowych różni się od tej w zdrowych komórkach. Dzięki nowemu podejściu badacze mogą generować dziesiątki tysięcy komórek z różnymi wariantami genów w szalkach Petriego. Następnie są w stanie określić, które z tych wariantów przyczyniają się do rozwoju nowotworu, a które sprawiają, że komórki nowotworowe stają się oporne na standardowe leki.
Połączenie dwóch metod
Naukowcy już wcześniej mieli możliwość dokonywania pojedynczych zmian w genomie komórek. Jednak projekt badawczy zespołu ETH był znacznie bardziej złożony: zmodyfikowali jeden gen w dwóch liniach komórek ludzkich w ponad 50 000 różnych sposobów, tworząc tym samym ogromną liczbę różnych wariantów komórek, a następnie testowali ich funkcje. W ramach dowodu koncepcji badali gen EGFR, który odgrywa kluczową rolę w rozwoju różnych typów nowotworów, w tym raka płuc, mózgu i piersi.
Platt i jego zespół połączyli dwie metody CRISPR-Cas, aby uzyskać dużą liczbę wariantów tego genu. Obie metody zostały opracowane w ostatnich latach przez naukowców z MIT i Harvard University w Stanach Zjednoczonych i mają swoje zalety oraz wady. Jedna z tych metod, edycja bazowa (base editing), pozwala na łatwe i niezawodne modyfikowanie pojedynczych elementów DNA, zwanych bazami. Możliwości edycji bazowej są jednak ograniczone: zazwyczaj można zamienić bazę C na T lub A na G.
Zmiana dziesiątek tysięcy komórek
Drugą metodą, którą zastosowali badacze, jest edycja pierwotna (prime editing). Teoretycznie jest to metoda bardzo potężna: podobnie jak funkcja “znajdź i zamień” w edytorze tekstu, pozwala na celowe zmiany sekwencji genetycznych. „Możemy zamieniać dowolną bazę DNA na inną. Możemy wstawiać, na przykład, trzy lub dziesięć baz do genomu lub usuwać ich taką samą liczbę”, mówi Platt. „W zasadzie możemy robić wszystko, co chcemy”.
Jednak edycja pierwotna nie zawsze działa niezawodnie, co utrudniało tworzenie dużej puli komórek z dziesiątkami tysięcy różnych modyfikacji, które mogłyby następnie zostać poddane testom przesiewowym. Platt i jego zespół teraz to osiągnęli.
Znaczenie dla onkologii
Pule komórek z różnymi wariantami genów są kluczowe dla badań, ponieważ onkolodzy coraz częściej analizują informacje genetyczne komórek nowotworowych pacjentów baza po bazie. Informacje te często dostarczają wskazówek, jakie leczenie może być skuteczne dla danego pacjenta.
W ostatnich latach naukowcy stworzyli bazy danych zawierające tysiące różnych wariantów genetycznych znalezionych u pacjentów. Dla około połowy tych wariantów bazy danych zawierają szczegółowy opis ich efektów. W przypadku pozostałych wariantów wiadomo jedynie, że występują u pacjentów, ale nie jest jasne, jaki mają wpływ na rozwój lub leczenie nowotworów. Naukowcy określają je jako „warianty o niepewnym znaczeniu” (variants of uncertain significance). Jeśli lekarz znajdzie taki wariant u pacjenta, informacja ta ma niewielką wartość praktyczną.
Badacze są przekonani, że onkologia skorzystałaby ogromnie z uzyskania większej ilości informacji na temat tych wariantów. Dlatego próbują produkować komórki z tymi wariantami genów w laboratorium, aby móc następnie analizować ich funkcję. W ostatnich latach wiele prac przygotowawczych zostało wykonanych, aby to umożliwić. Już wcześniej istniała możliwość zastosowania edycji bazowej jako metody, jednak problemem było to, że sama edycja bazowa nie wystarczała. „Pozwala jedynie na uzyskanie około jednej dziesiątej tych wariantów,” wyjaśnia Olivier Belli, doktorant w grupie Platta i, wraz z magistrantką Kyriaki Karavą, pierwszy autor badania.
Nowe, istotne warianty
Aby systematycznie generować komórki z praktycznie wszystkimi możliwymi, istotnymi wariantami genu EGFR, Platt i jego zespół najpierw zidentyfikowali regiony tego genu związane z nowotworami. Są to regiony, w których mutacje albo powodują transformację zdrowej komórki w komórkę nowotworową, albo sprawiają, że komórka nowotworowa staje się oporna lub, przeciwnie, wrażliwa na leki. Ponieważ nie jest możliwe stworzenie wszystkich tych wariantów genów za pomocą edycji bazowej, badacze zastosowali również metodę edycji pierwotnej.
Ostatecznie naukowcy przeanalizowali te komórki. Dla dziesięciu wariantów genu EGFR, których wpływ na progresję nowotworu był wcześniej nieznany, byli w stanie dostarczyć dowodów na ich znaczenie i je opisać: niektóre z tych wariantów mogą odgrywać rolę w rozwoju nowotworu, podczas gdy inne mogą sprawiać, że nowotwór staje się oporny na określone leki. W trakcie tego badania naukowcy z ETH odkryli również potencjalnie nowy mechanizm, dzięki któremu mutacja w genie EGFR może prowadzić do nowotworów. Ponadto znaleźli sześć wariantów genów, które wydają się odgrywać rolę w nowotworach, ale nigdy wcześniej nie były opisane – innymi słowy, całkowicie nowe, istotne warianty genetyczne.
Gen EGFR jest tylko jednym z kilkuset genów ludzkich związanych z nowotworami. To nowe podejście badawcze jest teraz gotowe do dekodowania wariantów o niepewnym znaczeniu we wszystkich pozostałych genach.
Źródło: Nature Biotechnology, ETH Zurichm, fot. TopMicrobialStock Adobe
