Mikrobiom plwociny w rozstrzeniach oskrzeli: podtyp Pseudomonas związany z większą ciężkością choroby

Analiza mikrobiomu plwociny u 58 klinicznie stabilnych pacjentów z rozstrzeniami oskrzeli niezwiązanymi z mukowiscydozą wykazała znaczną zmienność składu społeczności bakteryjnych pomiędzy chorymi. W badaniu przeprowadzonym w Portugalii wyodrębniono m.in. podtypy zdominowane przez Haemophilus, Streptococcus i Pseudomonas, przy czym podtyp Pseudomonas był związany z niższym FEV₁, większym nasileniem choroby według BSI oraz bardziej rozległymi zmianami radiologicznymi. Autorzy wskazują, że wyniki przemawiają za dalszym badaniem zależności między mikrobiomem, cechami anatomicznymi płuc i fenotypem klinicznym rozstrzeni oskrzeli.

Mikrobiom plwociny u stabilnych pacjentów z rozstrzeniami oskrzeli

Autorzy pracy „Sputum microbiome and clinical profiles in Portuguese non-cystic fibrosis bronchiectasis patients” skoncentrowali się na bakteryjnym mikrobiomie plwociny osób z rozstrzeniami oskrzeli niezwiązanymi z mukowiscydozą. Celem było scharakteryzowanie składu i różnorodności społeczności bakteryjnych oraz zestawienie tych danych z obrazem klinicznym, czynnością płuc i zmianami radiologicznymi.

Do badania włączono 58 pacjentów pozostających pod opieką ambulatoryjną Unidade Local de Saúde de São João w Porto w latach 2022-2023. Mediana wieku wynosiła 58 lat, a zakres wieku 17-87 lat. Kobiety stanowiły 59% kohorty.

Najczęstszą etiologią rozstrzeni oskrzeli była postać idiopatyczna – 23 osoby, czyli 40% badanych. U 11 pacjentów (19%) rozstrzenia miały etiologię pozakaźną, u 7 (12%) były związane z pierwotną dyskinezą rzęsek, a u 6 (10%) z astmą. Pozostałe przypadki obejmowały między innymi pierwotne i wtórne niedobory odporności, chorobę refluksową przełyku, alergiczną aspergilozę oskrzelowo-płucną oraz POChP.

Autorzy i ośrodki badawcze

Autorami publikacji są Ricardo Araujo, Luciana Oliveira, Inês Azevedo oraz Adelina Amorim. Badacze reprezentowali kilka jednostek związanych przede wszystkim z Universidade do Porto i opieką kliniczną w Porto.

W afiliacjach publikacji wymieniono:

• INEB – Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, Porto, Portugal,
• I3S – Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, Porto, Portugal,
• Centro de Referência de Fibrose Quística, Centro Hospitalar Universitário de S. João, Porto, Portugal,
• Centro de Ambulatório, Centro Hospitalar Universitário de São João, Unidade Local de Saúde São João Alameda Prof. Hernâni Monteiro, Porto, Portugal,
• RISE-Health, Departamento de Ginecologia-Obstetrícia e Pediatria, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Porto, Portugal,
• Serviço de Pediatria, Unidade Autónoma de Gestão da Mulher e da Criança, Centro Hospitalar Universitário de S. João, Unidade Local de Saúde São João, Alameda, Portugal,
• Serviço de Pneumologia, Unidade Autónoma de Gestão da Medicina, Centro Hospitalar Universitário de São João, Unidade Local de Saúde São João, Porto, Portugal,
• Departamento de Medicina, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Porto, Portugal.

Praca została opublikowana w czasopiśmie Pulmonology. Artykuł wpłynął do redakcji 10 listopada 2025 r., został zaakceptowany 3 września 2026 r. i opublikowany online 14 września 2026 r.

Jak przeprowadzono badanie?

Dobór pacjentów i pobieranie próbek

Kryteriami włączenia były wiek co najmniej 12 lat, rozpoznanie rozstrzeni oskrzeli na podstawie tomografii komputerowej wysokiej rozdzielczości, zdolność do spontanicznego odkrztuszania plwociny, stabilność kliniczna oraz uzyskanie odpowiedniej zgody pacjenta lub opiekuna. Ostatecznie wiek osób uczestniczących w badaniu mieścił się w zakresie 17-87 lat.

Wykluczono chorych na mukowiscydozę oraz osoby, które w poprzedzającym miesiącu długotrwale stosowały antybiotyki wziewne lub makrolidy. Stabilność kliniczną zdefiniowano jako brak zaostrzenia i brak zmiany terapii w okresie do 4 tygodni poprzedzających zebranie danych.

Przewlekłe zakażenie autorzy definiowali jako co najmniej dwa dodatnie posiewy wykazujące tę samą bakterię, uzyskane w odstępie co najmniej 3 miesięcy podczas 12 miesięcy poprzedzających włączenie do badania.

Stopień duszności oceniano skalą mMRC, ropność plwociny skalą Murraya, natomiast ogólne nasilenie rozstrzeni oskrzeli przy użyciu bronchiectasis severity index (BSI). Uwzględniono również dane z najnowszej spirometrii oraz cechy radiologiczne dotyczące rozmieszczenia i morfologii rozstrzeni oskrzeli.

Analiza DNA i sekwencjonowanie 16S rRNA

Od każdego uczestnika pobrano jedną spontanicznie odkrztuszoną próbkę plwociny podczas rutynowej wizyty ambulatoryjnej. Materiał przechowywano bezpośrednio po pobraniu w temperaturze -80°C.

DNA bakteryjne izolowano z próbek plwociny po uprzedniej optymalizacji procedury ekstrakcji. Autorzy zastosowali między innymi Sputasol oraz DNeasy Blood & Tissue Kit z dodatkowym etapem lizy komórek przy użyciu szklanych kulek.

Do amplifikacji zastosowano parę starterów 338F/806R. Po przygotowaniu bibliotek sekwencjonowanie wykonano na platformie Illumina NovaSeq 6000 z zastosowaniem strategii paired-end 250.

Warianty sekwencji amplikonów identyfikowano z wykorzystaniem metody DADA2. Klasyfikację taksonomiczną przeprowadzono na podstawie bazy Silva w wersji 138.1. Liczba końcowych odczytów w poszczególnych próbkach wynosiła od około 7000 do 50 000.

Autorzy analizowali α-różnorodność za pomocą indeksu Shannona oraz β-różnorodność z wykorzystaniem podobieństwa Bray-Curtisa. W analizach wielowymiarowych zastosowano między innymi ANOSIM i PERMANOVA, a w analizach post hoc STAMP. ANCOM-BC v2 wykorzystano do uwzględnienia charakteru kompozycyjnego danych i błędu związanego z pobieraniem próbek oraz do korekcji false discovery rate metodą Benjamini-Hochberga.

Mikrobiom plwociny był silnie zróżnicowany pomiędzy pacjentami

W próbkach plwociny zidentyfikowano ponad 10 000 wariantów ASV. Po klasyfikacji taksonomicznej zagregowano je do 2027 grup taksonomicznych, z których 1395 udało się określić na poziomie rodzaju.

Wśród często identyfikowanych rodzajów znajdowały się między innymi Haemophilus, Streptococcus, Pseudomonas, Rothia, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, Gemella, Fusobacterium, Actinomyces, Leptotrichia i Neisseria.

Na poziomie typu profile były najczęściej zdominowane przez Pseudomonadota – dawniej Proteobacteria – które stanowiły 36%, lub Bacillota – dawniej Firmicutes – 30%. Kolejne były Actinomycetota – 14% oraz Bacteroidota – 11%.

Średnia wartość indeksu Shannona wyniosła 4,40 ± 1,01 i mieściła się w zakresie od 1,31 do 6,35, co odzwierciedlało znaczną zmienność α-różnorodności między próbkami.

Cztery najważniejsze podtypy

Podtyp określano na podstawie dominującego rodzaju bakterii. Dominację definiowano jako udział przekraczający 20% całego profilu, a współdominację jako co najmniej 20% dla każdego z kilku dominujących rodzajów.

• Haemophilus – 14 pacjentów, 24,1%,
• Streptococcus – 14 pacjentów, 24,1%,
• Pseudomonas – 8 pacjentów, 13,8%,
• Rothia/Streptococcus – 6 pacjentów, 10,3%.

Ponadto stwierdzono podtyp Moraxella u 4 pacjentów oraz rzadkie podtypy Staphylococcus, Neisseria, Prevotella i Mycoplasma. U 5 osób, czyli około 9% kohorty, nie występował jeden wyraźnie dominujący rodzaj, a profile były bardzo zróżnicowane.

Podtyp Pseudomonas a ciężkość rozstrzeni oskrzeli

Różnice pomiędzy podtypami nie ograniczały się do składu mikrobiologicznego. Autorzy wykazali również odmienne profile kliniczne, czynnościowe i radiologiczne.

Średnie FEV₁ wyrażone jako procent wartości należnej było niższe w podtypach Prevotella, Pseudomonas i Moraxella – odpowiednio 63,4%, 58,5% i 49,1%. Dla podtypów Haemophilus, Streptococcus, Rothia/Streptococcus oraz pozostałych wynosiło powyżej 70%.

Podtyp Pseudomonas wiązał się w tomografii komputerowej z rozlanymi rozstrzeniami oskrzeli oraz współwystępowaniem zmian cylindrycznych, żylakowatych i torbielowatych. Był również silnie związany ze stosowaniem wziewnych glikokortykosteroidów (wGKS; ang. inhaled corticosteroids, ICS).

W analizie porównującej łagodniejsze i cięższe przypadki według BSI podtyp Haemophilus występował przede wszystkim w przypadkach o łagodniejszym nasileniu, natomiast Pseudomonas był częstszy przy wysokim BSI. Najsilniejszy wynik uzyskany w analizie ANCOM-BC dotyczył właśnie większego udziału Pseudomonas u pacjentów z wysokim BSI.

α-różnorodność, lewy dolny płat i IgA

α-różnorodność określana indeksem Shannona była istotnie mniejsza u pacjentów z zajęciem lewego dolnego płata – p=0,020.

Stwierdzono także zależność z wartościami IgA. Pacjenci z niskimi stężeniami IgA mieli istotnie większą różnorodność według indeksu Shannona niż osoby z wysokim IgA – p<0,050. Nie stwierdzono natomiast istotnej różnicy względem osób z prawidłowym IgA.

W całej badanej kohorcie autorzy nie stwierdzili związku α-różnorodności z czynnością płuc.

β-różnorodność i czynniki kliniczne

Analiza β-różnorodności wskazała na różnice mikrobiomu związane z kilkoma zmiennymi klinicznymi. Odnotowano związek z BSI przy p=0,034, jednak wynik ten nie został potwierdzony w analizie PERMANOVA, w której p wyniosło 0,173. Sami autorzy zaznaczyli, że zależność z BSI powinna być z tego powodu interpretowana ostrożnie.

β-różnorodność była również istotnie związana z wskaźnikiem masy ciała – p=0,004, OB – p=0,018 oraz obecnością rozstrzeni oskrzeli w lewym dolnym płacie – p=0,037. Te wyniki zostały potwierdzone w PERMANOVA.

Przewlekłe zakażenie a profil uzyskany z sekwencjonowania

Przewlekłe zakażenie bakteryjne stwierdzane za pomocą konwencjonalnych posiewów w ciągu 12 miesięcy przed włączeniem występowało u 34 z 58 pacjentów, czyli 59% kohorty.

Najczęściej było związane z Pseudomonas aeruginosa – 18 pacjentów – i Haemophilus influenzae – 8 pacjentów. Ponadto stwierdzano w posiewach metycylinowrażliwy Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis i Stenotrophomonas maltophilia.

U 20 z 34 pacjentów z wcześniej rozpoznanym przewlekłym zakażeniem odpowiadająca mu bakteria należała do pięciu najliczniej reprezentowanych taksonów w aktualnie analizowanym mikrobiomie plwociny. U 4 osób wcześniejszej bakterii przewlekłego zakażenia nie udało się wykryć lub zidentyfikować w analizowanej próbce mikrobiomu.

Autorzy zwracają uwagę, że posiew i sekwencjonowanie mogą być zgodne szczególnie w odniesieniu do takich bakterii jak Pseudomonas, Staphylococcus i Haemophilus, natomiast konwencjonalne metody hodowlane mogą nie odzwierciedlać całej różnorodności społeczności bakteryjnej plwociny.

Etiologia rozstrzeni oskrzeli i wiek początku objawów

Nie udało się przypisać jednego wyraźnego podtypu mikrobiomu do konkretnej etiologii rozstrzeni oskrzeli. W próbkach pacjentów z pierwotną dyskinezą rzęsek dominowały jednak podtypy Streptococcus lub Haemophilus, a 5 spośród 6 osób należących do podtypu Rothia/Streptococcus miało idiopatyczne rozstrzenia oskrzeli.

Podtyp Haemophilus przeważał w przypadkach, w których pierwsze objawy pojawiały się wcześnie – przed ukończeniem 6. roku życia. Podtyp Rothia/Streptococcus wiązał się natomiast z późniejszym początkiem objawów. Zależności tej nie obserwowano podczas analizy wieku, w którym formalnie rozpoznano rozstrzenia oskrzeli.

Ograniczenia badania

Wnioski autorów i znaczenie dla praktyki klinicznej

Autorzy określają badanie jako pierwszą charakterystykę mikrobiomu plwociny u klinicznie stabilnych portugalskich pacjentów z rozstrzeniami oskrzeli. Pomimo stabilnego stanu klinicznego i braku długotrwałego leczenia antybiotykami wykazano znaczną zmienność między pacjentami i możliwość wyróżnienia kilku podtypów mikrobiologicznych.

Najbardziej wyraźne różnice obserwowano pomiędzy podtypami Haemophilus i Pseudomonas. Podtyp Pseudomonas był związany z większą ciężkością choroby. Autorzy wskazują również na możliwe znaczenie zajęcia lewego dolnego płata oraz zależności pomiędzy mikrobiomem, IgA, wiekiem początku objawów i wskaźnikami ciężkości choroby.

Przyszłe badania powinny według autorów obejmować większe populacje i wielokrotne pobieranie próbek w czasie. Pozwoliłoby to ocenić, czy obserwowane podtypy są stabilne, jak zmieniają się wraz z przebiegiem rozstrzeni oskrzeli oraz czy mają znaczenie prognostyczne lub terapeutyczne.