Zablokowanie NMT1 osłabia SARS-CoV-2 i RSV. Nowa strategia przeciwwirusowa uderza w komórkę gospodarza

Zamiast bezpośrednio atakować białko wirusa, można spróbować odebrać patogenowi dostęp do mechanizmów komórki gospodarza, których potrzebuje do prawidłowego namnażania. Badacze z The University of Queensland, University of Helsinki i innych ośrodków wykazali, że zahamowanie N-myristoyltransferase 1 (NMT1) zaburza wewnątrzkomórkowy transport wykorzystywany przez SARS-CoV-2. Wirus nadal może wytwarzać potomne cząstki, ale część z nich ma nieprawidłowo dojrzałe białko S i znacznie mniejszą zdolność zakażania kolejnych komórek.

W doświadczeniach efekt obserwowano wobec kilku wariantów SARS-CoV-2, a także respiratory syncytial virus (RSV) i vesicular stomatitis virus (VSV). Najważniejsze dane dotyczą jednak modeli komórkowych i organoidowych. Nie przeprowadzono jeszcze badania klinicznego tej strategii u pacjentów, dlatego wyniki należy interpretować jako obiecujący etap rozwoju terapii ukierunkowanej na gospodarza, a nie jako dowód skuteczności nowego leczenia COVID-19 lub zakażenia RSV.

Dlaczego NMT1 stała się celem terapii przeciwwirusowej

Klasyczne leki przeciwwirusowe są najczęściej projektowane tak, aby blokować element bezpośrednio należący do wirusa, np. jego proteazę, polimerazę lub inne białko niezbędne do replikacji. Takie podejście ma dużą wartość kliniczną, ale wiąże się również z możliwością selekcji wariantów, w których zmiany sekwencji docelowego białka zmniejszają wrażliwość na lek.

Alternatywą jest host-directed antiviral therapy – terapia ukierunkowana na mechanizm należący do komórki gospodarza, który wirus wykorzystuje podczas swojego cyklu życiowego. Właśnie taki kierunek obrali Saber H. Saber, Nyakuoy Yak, Konstantin Dolski, Sanna Mäki, Merja Joensuu, Giuseppe Balistreri i pozostali autorzy pracy opublikowanej w „Nature Communications”.

Badacze zainteresowali się enzymami N-myristoyltransferase 1 i 2 – NMT1 oraz NMT2. Katalizują one N-myristoylację białek, czyli modyfikację lipidową wpływającą między innymi na wiązanie białek z błonami komórkowymi, ich lokalizację i udział w procesach transportu wewnątrzkomórkowego.

Ma to szczególne znaczenie dla błon retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego. SARS-CoV-2 intensywnie wykorzystuje układ błon komórki gospodarza podczas tworzenia, dojrzewania i transportowania swoich potomnych cząstek.

Co istotne, genom SARS-CoV-2 nie zawiera oczywistych sekwencji kodujących miejsca typowej N-myristoylacji. Oznacza to, że w przypadku tego koronawirusa inhibitor NMT nie musi działać poprzez bezpośrednie pozbawienie wirusowego białka jego modyfikacji lipidowej. Autorzy postawili inną hipotezę: zahamowanie NMT może zmieniać funkcjonowanie białek gospodarza odpowiedzialnych za transport błonowy, a tym samym pośrednio zakłócać cykl życiowy wirusa.

Od obserwacji w biologii komórki do koncepcji przeciwwirusowej

Dr Merja Joensuu z Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology przy The University of Queensland opisywała później, że punktem wyjścia była obserwacja dokonana podczas badań nad procesami zachodzącymi w ludzkich komórkach. Zauważone zaburzenie szlaku transportowego wykorzystywanego przez liczne wirusy doprowadziło do pytania, czy można farmakologicznie wymusić podobne zakłócenie i w ten sposób utrudnić wirusom prawidłowe formowanie potomstwa.

W badaniach uczestniczyli naukowcy reprezentujący m.in. Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology i Queensland Brain Institute przy The University of Queensland, Department of Virology, Medicum Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, School of Chemistry and Molecular Biosciences przy The University of Queensland, The Francis Crick Institute, Imperial College London, HUS Diagnostic Center oraz inne jednostki. Wśród afiliacji znalazł się również Department of Tropical Parasitology, Institute of Maritime and Tropical Medicine, Gdański Uniwersytet Medyczny.

Jak zaprojektowano badanie i jakie modele zastosowano

Autorzy nie ograniczyli się do jednego typu komórek. Punktem wyjścia były komórki A549 z ekspresją ACE2 i TMPRSS2, określane w pracy jako A549-AT. ACE2 stanowi receptor wykorzystywany przez SARS-CoV-2, a TMPRSS2 uczestniczy w proteolitycznej aktywacji białka S.

W kolejnych doświadczeniach zastosowano komórki Calu-3 pochodzące z ludzkiego nabłonka dróg oddechowych, które endogennie wykazują ekspresję ACE2 i TMPRSS2. Ważnym elementem pracy były ponadto pierwotne komórki nabłonka nosa pozyskane od trzech dorosłych dawców i różnicowane na granicy faz powietrze–ciecz. Powstały w ten sposób pseudowielowarstwowe hodowle śluzowo-rzęskowe zawierające rzęski i śluz, a więc znacznie lepiej odwzorowujące górne drogi oddechowe niż prosta hodowla jednowarstwowa.

Badacze wykorzystali również model ludzkich organoidów zawierających splot naczyniówkowy i struktury korowe, aby sprawdzić, czy obserwowany efekt ogranicza się do modeli nabłonka oddechowego.

Głównym inhibitorem był IMP1088 – bardzo silny inhibitor NMT1 i NMT2. Testowano również IMP1320, rozpuszczalną w wodzie pochodną inhibitora NMT. Aby ustalić, który z dwóch ludzkich enzymów odpowiada za działanie przeciwwirusowe, autorzy wykorzystali CRISPR interference i oddzielnie zmniejszali ekspresję NMT1 oraz NMT2.

W przypadku SARS-CoV-2 analizowano szczep ancestralny oraz warianty Alpha, Delta i Omicron. Dodatkowo badano RSV, VSV oraz Semliki Forest virus (SFV).

Jak silnie IMP1088 ograniczał zakażenie SARS-CoV-2 i RSV

W komórkach A549-AT leczonych IMP1088 w stężeniach od 62,5 nM do 1 µM poziom zakażenia ancestralnym SARS-CoV-2 był po 24 godzinach o około połowę niższy niż w kontroli. Porównywalny efekt obserwowano niezależnie od tego, czy inhibitor podawano 1,5 godziny przed zakażeniem, czy 1,5 godziny po zakażeniu.

Po 48 godzinach różnica stała się jeszcze bardziej wyraźna. Leczenie IMP1088 zmniejszało poziom zakażenia o około 80–90% i ograniczało powstawanie syncytiów, czyli wielojądrzastych struktur będących następstwem fuzji zakażonych komórek.

W doświadczeniach uzupełniających efekt utrzymywał się bardzo długo. Po 72 godzinach zakażenie ancestralnym SARS-CoV-2 w modelu A549-AT było ograniczone o około 98% względem kontroli niezależnie od długości wcześniejszej ekspozycji na IMP1088. Autorzy wiążą to z bardzo wysokim powinowactwem inhibitora do NMT oraz wolnym obrotem enzymu w badanych komórkach.

Działanie wobec wariantów Alpha, Delta i Omicron

Efekt nie był ograniczony do ancestralnego SARS-CoV-2. IMP1088 istotnie zmniejszał również zakażenie wariantami Delta i Omicron w modelu A549-AT. W pierwotnym, zróżnicowanym nabłonku nosa silne działanie przeciwwirusowe wykazano wobec wariantu Alpha.

W modelu Calu-3 odpowiedź miała nieco inną dynamikę. Krótkie, 1,5-godzinne podanie przed zakażeniem nie wystarczało do uzyskania wyraźnego efektu, natomiast wcześniejsza, 24-godzinna ekspozycja na IMP1088 prowadziła do istotnego ograniczenia zakażenia. Różnica ta pokazuje, że zależność efektu od czasu ekspozycji może być odmienna w różnych typach komórek.

Pierwotny nabłonek nosa potwierdził działanie w bardziej fizjologicznym modelu

Jednym z najważniejszych elementów pracy z perspektywy pulmonologii jest doświadczenie przeprowadzone w pseudowielowarstwowym nabłonku śluzowo-rzęskowym nosa. Komórki pochodziły od trzech dorosłych dawców i po różnicowaniu na granicy faz powietrze–ciecz wytwarzały rzęski oraz śluz.

Hodowle leczono 1 µM IMP1088, a następnie zakażano wariantem Alpha SARS-CoV-2 na 72 godziny. W tych warunkach inhibitor silnie ograniczał zakażenie. Nie jest to jeszcze model całego organizmu, ale biologicznie ma większe znaczenie niż obserwacja dokonana wyłącznie w transformowanej linii komórkowej, ponieważ odtwarza część cech nabłonka będącego pierwszym miejscem kontaktu SARS-CoV-2 z drogami oddechowymi.

RSV również okazał się wrażliwy na zahamowanie NMT

IMP1088 testowano także wobec RSV, VSV i SFV. Zahamowanie NMT istotnie ograniczało zakażenie RSV oraz VSV. Nie obserwowano natomiast porównywalnego efektu wobec SFV.

Ta różnica jest istotna interpretacyjnie. Nie można na podstawie obecnych danych stwierdzić, że zahamowanie NMT1 jest uniwersalną strategią działającą na wszystkie wirusy. Poszczególne patogeny w różnym stopniu wykorzystują transport błonowy i inne procesy gospodarza, a znaczenie NMT może zależeć od biologii konkretnego wirusa.

Jak zaburzenie ER-ERGIC-Golgi prowadzi do powstawania mniej zakaźnych wirionów

Najbardziej interesująca część pracy dotyczy mechanizmu działania IMP1088. Wyniki wskazują, że inhibitor nie działa przede wszystkim poprzez uniemożliwienie SARS-CoV-2 wejścia do komórki.

W ciągu pierwszych 6 godzin po zakażeniu nie stwierdzono wykrywalnego zmniejszenia ilości białka N ani dsRNA pod wpływem IMP1088. Dane te przemawiają przeciwko istotnemu wpływowi na samo wejście wirusa, wczesną syntezę białek lub najwcześniejszy etap replikacji RNA. Spadek liczby kopii RNA wirusa zaczynał być widoczny od około 8. godziny po zakażeniu.

Kluczowe zmiany dotyczyły dalszej części cyklu życiowego wirusa, obejmującej organizację błon komórkowych, dojrzewanie białka S, składanie wirionów i ich transport.

ERGIC i aparat Golgiego ulegają dezorganizacji

Finalne etapy składania SARS-CoV-2 są ściśle związane z retikulum endoplazmatycznym, ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) oraz aparatem Golgiego. W tych przedziałach zachodzą procesy ważne dla dojrzewania białka S, w tym glikozylacja i proteolityczne przetwarzanie.

Po zahamowaniu NMT autorzy obserwowali wyraźne zmiany morfologii wczesnego szlaku sekrecyjnego. Struktury ERGIC i aparatu Golgiego ulegały rozproszeniu, zaburzony był transport z retikulum endoplazmatycznego w kierunku aparatu Golgiego, a światło niektórych przedziałów błonowych było poszerzone.

Mikroskopia elektronowa pokazała, że w komórkach kontrolnych wiriony można było odnaleźć w przedziałach związanych z ER, ERGIC i aparatem Golgiego. Po zahamowaniu NMT ich dystrybucja ulegała zmianie. Wirusy były kierowane na alternatywną drogę transportu z udziałem retikulum endoplazmatycznego i struktur lizosomalnych, z pominięciem klasycznego przejścia przez aparat Golgiego.

Golgi-bypassing egress – wirus znajduje drogę wyjścia, ale płaci za to jakością potomstwa

Autorzy określają obserwowany mechanizm jako Golgi-bypassing egress. SARS-CoV-2 nie zostaje więc po prostu całkowicie uwięziony wewnątrz komórki. Część potomnych wirionów może nadal zostać uwolniona, ale omijanie prawidłowej drogi dojrzewania ma konsekwencje dla ich składu.

Szczególnie wyraźne zmiany dotyczyły białka S. W wirionach uwalnianych z komórek leczonych IMP1088 stwierdzano mniejszą ilość tego białka oraz zaburzone jego proteolityczne rozszczepienie. Proces ten ma znaczenie funkcjonalne, ponieważ prawidłowe dojrzewanie spike warunkuje efektywne zakażanie kolejnych komórek.

Najbardziej bezpośredni dowód uzyskano w eksperymencie ponownego zakażania. Badacze zebrali cząstki SARS-CoV-2 uwolnione z komórek kontrolnych oraz z komórek traktowanych IMP1088, a następnie do kolejnych hodowli podali równoważną liczbę kopii wirusowego RNA. Wiriony powstające w obecności inhibitora były około 90% mniej zakaźne niż potomstwo pochodzące z komórek kontrolnych.

Oznacza to, że sama liczba uwalnianych kopii materiału genetycznego nie opisuje w pełni działania leku. Zahamowanie NMT zmieniało biologiczną jakość powstających cząstek wirusowych.

NMT1, a nie NMT2, jest głównym mediatorem efektu

IMP1088 oddziałuje zarówno na NMT1, jak i NMT2. Autorzy zastosowali więc CRISPR interference, aby ustalić, który enzym ma większe znaczenie dla SARS-CoV-2.

Częściowe wyciszenie NMT1 zmniejszało poziom zakażenia, a po połączeniu trzech sgRNA i uzyskaniu niemal całkowitego usunięcia wykrywalnego białka NMT1 zakażenie SARS-CoV-2 po 48 godzinach było mniejsze o około 60%.

W przypadku NMT2 sytuacja wyglądała inaczej. Pomimo uzyskania niewykrywalnego poziomu białka NMT2 nie stwierdzono porównywalnego zmniejszenia zakażenia. Wynik wskazuje zatem NMT1 jako główny mediator działania przeciwwirusowego obserwowanego podczas farmakologicznego hamowania NMT.

Co oznacza ukierunkowanie terapii na komórkę gospodarza

Strategia host-directed ma potencjalną przewagę nad lekami wiążącymi pojedyncze białko wirusowe. Cel farmakologiczny – w tym przypadku NMT1 – jest kodowany przez genom gospodarza, więc wirus nie może bezpośrednio zmienić jego sekwencji poprzez mutację własnego genomu.

Nie oznacza to jednak, że oporność na taką terapię jest niemożliwa. Wirusy mogą ewoluować w kierunku innego wykorzystywania szlaków komórkowych, zmieniać zależność od określonych białek gospodarza albo rozwijać mechanizmy kompensacyjne. Obecne badanie nie było eksperymentem ewolucyjnym dotyczącym długotrwałej selekcji oporności.

Autorzy przeprowadzili jednak analizę sekwencji potomnych SARS-CoV-2. Na poziomie konsensusowym sekwencje wirusów pochodzących z komórek kontrolnych i leczonych IMP1088 były zgodne, a analiza wariantów mniejszościowych nie wykazała charakterystycznego zwiększenia mutagenezy związanego z inhibitorem. Wynik przemawia przeciwko mechanizmowi, w którym działanie IMP1088 wynikałoby z indukowania licznych mutacji w genomie wirusa.

IMP1088 nie jest tym samym związkiem, który znajduje się w badaniach onkologicznych

W materiałach prasowych dotyczących pracy pojawia się określenie „cancer drug”, co wymaga doprecyzowania. W najważniejszych doświadczeniach przeciwwirusowych autorzy wykorzystywali IMP1088 oraz jego rozpuszczalną w wodzie pochodną IMP1320.

W samej publikacji wskazano natomiast, że inny inhibitor NMT – PCLX-001 – jest związkiem aktywnym in vivo i był rozwijany w badaniach klinicznych w onkologii. Autorzy przywołują ten fakt jako dowód, że farmakologiczne hamowanie NMT może być osiągalne również w całym organizmie. Nie jest to jednak równoznaczne z wykazaniem przeciwwirusowej skuteczności PCLX-001 u ludzi ani z prowadzeniem badania klinicznego IMP1088 w COVID-19 lub zakażeniu RSV.

Co wiadomo o cytotoksyczności?

Ze względu na to, że NMT1 jest enzymem ludzkiej komórki, bezpieczeństwo jest jednym z najważniejszych zagadnień dla dalszego rozwoju tej strategii.

W komórkach A549-AT IMP1088 nie powodował istotnego pogorszenia żywotności do stężenia 1 µM podczas 48-godzinnej ekspozycji. Przy 10 µM stwierdzono umiarkowane, około 20-procentowe zmniejszenie żywotności.

W pierwotnych komórkach nabłonka nosa odpowiedź była zależna od dawcy. Przy 1 µM w jednej z trzech badanych hodowli obserwowano niewielkie zmniejszenie żywotności, podczas gdy dwie pozostałe nie wykazywały takiego efektu. Przy 10 µM spadek żywotności lub tendencję spadkową stwierdzano we wszystkich próbkach.

IMP1320 wykazywał natomiast silne działanie przeciw SARS-CoV-2 w A549-AT bez wykrywalnej cytotoksyczności w zastosowanych warunkach eksperymentalnych.

Dlaczego droga do leku donosowego lub wziewnego jest jeszcze długa

Z perspektywy pulmonologii szczególnie interesująca jest możliwość miejscowego podawania inhibitora do układu oddechowego. Dr Merja Joensuu wskazywała w materiale prasowym, że hipotetycznie można wyobrazić sobie taką strategię w postaci preparatu donosowego lub inhalacyjnego.

Biologiczne uzasadnienie jest czytelne: SARS-CoV-2 i RSV namnażają się w nabłonku dróg oddechowych, dlatego dostarczenie substancji bezpośrednio w miejsce zakażenia mogłoby umożliwić uzyskanie wysokiego stężenia miejscowego przy ograniczeniu ekspozycji ogólnoustrojowej. Nie zostało to jednak przetestowane w omawianej pracy.

Nie badano inhalacyjnego ani donosowego preparatu IMP1088 u zwierząt czy ludzi. Nie określono dawki klinicznej, biodostępności po podaniu wziewnym, depozycji w drogach oddechowych, tolerancji miejscowej, wpływu na nabłonek śluzowo-rzęskowy ani bezpieczeństwa powtarzanego stosowania.

Dlaczego ta praca jest ważna dla badań nad wirusami oddechowymi

Praca pokazuje interesującą zmianę perspektywy. Celem terapii nie musi być zawsze bezpośrednie zahamowanie enzymu wirusowego. Możliwe jest również doprowadzenie do sytuacji, w której zakażona komórka staje się gorszym środowiskiem do prawidłowego składania i dojrzewania wirionów.

W przypadku SARS-CoV-2 zahamowanie NMT powodowało dezorganizację transportu ER-ERGIC-Golgi, przekierowanie potomnych cząstek na drogę uwalniania omijającą aparat Golgiego oraz zaburzenie prawidłowego dojrzewania białka S. Rezultatem były wiriony o znacznie mniejszej zdolności do zakażania kolejnych komórek.

Obserwacja działania także wobec RSV zwiększa zainteresowanie tą strategią w pulmonologii. Jednocześnie brak aktywności wobec SFV przypomina, że zależność wirusów od mechanizmów gospodarza jest zróżnicowana i wymaga indywidualnej oceny dla każdego patogenu.

Na obecnym etapie najbardziej uzasadniony wniosek nie brzmi więc „powstał nowy lek przeciwwirusowy”, lecz: zidentyfikowano mechanizm komórkowy, którego farmakologiczne zaburzenie może znacząco obniżyć zakaźność potomstwa wybranych wirusów, w tym dwóch ważnych patogenów układu oddechowego – SARS-CoV-2 i RSV.